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CERO生物反應(yīng)器在阿爾茨海默病研究中的應(yīng)用
本研究探討了人類外周血單核細胞（hPBMCs）固定化對其在阿爾茨海默病細胞模型中依賴于Аβ42 聚集物的促炎狀態(tài)的影響。結(jié)果顯示，固定化細胞對異源刺激的基本指標水平及響應(yīng)強度***高于懸浮細胞，且β1 整合素在細胞 - 基質(zhì)粘附中起關(guān)鍵作用，阻斷后可抑制 rAβ42 誘導的 TNFα 和 Aβ40 積累，提示細胞粘附因素對研究結(jié)果的重要性130。
一、研究背景與目的
1. 阿爾茨海默病（AD）病理基礎(chǔ)：主要與淀粉樣變性和炎癥相關(guān)，Aβ40 和 Aβ42 是關(guān)鍵的淀粉樣 β 肽異構(gòu)體，其中 Aβ42 更易聚集且致病性更強2。
2. 研究意義：外周血單核細胞（PBMC）常被用于評估 AD 相關(guān)分子（如 Aβ42）引發(fā)的細胞因子變化，但傳統(tǒng)懸浮培養(yǎng)未考慮細胞粘附因素，可能與體內(nèi)環(huán)境存在差異，影響研究結(jié)果12。
3. 研究目的：探究 hPBMCs 的細胞 - 基質(zhì)粘附對其體外促炎狀態(tài)的影響，比較懸浮細胞與固定化細胞對 Aβ42 刺激的響應(yīng)，并分析 β1 整合素的作用13。
二、材料與方法1. 細胞來源與處理
1. 來源：健康成年捐贈者的 hPBMCs，經(jīng) Ficoll–Hypaque 方法分離，保存在 CryoStor® CS10 培養(yǎng)基中，細胞活力 92.0%，濃度 1.5×10?/ml456。
2. 培養(yǎng)方式：
l 懸浮培養(yǎng)：RPMI-1640 培養(yǎng)基（含 10.0% 胎牛血清等），24 孔板培養(yǎng) 24 小時（37.0±0.1°C、5.0±0.1% CO?）78。
l 固定化培養(yǎng)：CERO 生物反應(yīng)器用于固定化細胞的培養(yǎng)，控制培養(yǎng)環(huán)境參數(shù)。采用 GEM 技術(shù)，將細胞固定在含 1.0% I 型膠原蛋白、0.5% RGD 肽和 1.0% 纖連蛋白的藻酸鹽微載體表面，在生物反應(yīng)器中培養(yǎng) 24 小時91011。
CERO 3D細胞(類***)生物反應(yīng)器
1. 實驗處理
1. rAβ42 刺激：濃度 15nM，超聲處理分散聚集體后加入細胞培養(yǎng)體系1213。
2. β1 整合素阻斷：hPBMCs 與抗 β1 整合素抗體（1:200）在 37°C 孵育 30 分鐘后進行固定化培養(yǎng)1415。
2. 檢測方法
1. 細胞因子（TNFα、IL-1β）和 Aβ40 含量：采用 ELISA 試劑盒，在 FL600 微孔板多模式閱讀器上檢測，結(jié)果以 ng/g 總蛋白表示161718。
2. 活細胞成像：使用激光掃描共聚焦顯微鏡（FV10i-LIV），通過熒光探針 CRANAD-2 和 MCAAD-3 分別觀察 rAβ42 和 Aβ40 的定位與積累，計算比值指數(shù) R（rAβ42/Aβ40）192021。
3. 統(tǒng)計分析：單因素方差分析（ANOVA）結(jié)合 Tukey 多重比較檢驗，p<0.05 為差異***22。三、研究結(jié)果1. 細胞因子和 Aβ40 的變化
1. 無 rAβ42 時：TNFα 和 Aβ40 含量在 24 小時內(nèi)無***變化，IL-1β 含量在 24 小時后***降低（懸浮細胞：285.2±15.6 ng/g；固定化細胞：304.1±15.5 ng/g）232627。
2. 有 rAβ42 時：
l TNFα 含量增加，24 小時時懸浮細胞達 108.3±11.5 ng/g，固定化細胞達 161.6±9.2 ng/g2627。
l Aβ40 含量增加，24 小時時懸浮細胞達 67.5±5.1 ng/g，固定化細胞達 89.2±4.2 ng/g2627。
l IL-1β 未觀察到積累23。
2. 肽的定位與比值變化
1. Aβ40 在細胞質(zhì)中積累，rAβ42 在細胞膜外表面聚集24。
2. 比值指數(shù) R（rAβ42/Aβ40）：懸浮細胞從 0.08 升至 0.76，固定化細胞從 0.06 升至 0.42，固定化細胞比值更低25。
3. β1 整合素阻斷的影響：阻斷后，固定化細胞中 TNFα 和 Aβ40 的積累***受抑制（TNFα：72.8±5.5 ng/g；Aβ40：77.9±5.5 ng/g），但仍高于懸浮細胞2829。四、結(jié)論1. 固定化細胞對異源 Aβ42 刺激的基本指標水平及響應(yīng)強度***高于懸浮細胞30。
2. 細胞 - 基質(zhì)粘附（由 β1 整合素介導）可增強 hPBMCs 的信號轉(zhuǎn)導和合成活性30。
3. 傳統(tǒng)懸浮培養(yǎng)未考慮細胞粘附因素，可能導致研究健康或 AD 患者來源的 hPBMCs 對外源性刺激的反應(yīng)時得出錯誤結(jié)論30。
關(guān)鍵問題：問題：固定化培養(yǎng)的 hPBMCs 與懸浮培養(yǎng)的 hPBMCs 對 rAβ42 刺激的響應(yīng)存在哪些主要差異？
答案：主要差異體現(xiàn)在響應(yīng)強度上，固定化細胞的 TNFα 和 Aβ40 積累量***高于懸浮細胞。例如，與 rAβ42 孵育 24 小時后，固定化細胞的 TNFα 含量（161.6±9.2 ng/g）高于懸浮細胞（108.3±11.5 ng/g），Aβ40 含量（89.2±4.2 ng/g）也高于懸浮細胞（67.5±5.1 ng/g）；同時，固定化細胞的 rAβ42/Aβ40 比值上升幅度小于懸浮細胞，且細胞內(nèi)肽的分布異質(zhì)性更***252627。
問題：β1 整合素在 hPBMCs 的固定化效應(yīng)中起到了怎樣的作用？
答案：β1 整合素介導了細胞與基質(zhì)的粘附，對固定化 hPBMCs 的促淀粉樣蛋白生成和促炎狀態(tài)有重要影響。與 β1 整合素阻斷抗體孵育后，固定化細胞在 rAβ42 處理下的 TNFα 和 Aβ40 積累***受抑制，但仍高于懸浮細胞，表明 β1 整合素是細胞 - 基質(zhì)粘附增強細胞響應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)之一152829。
問題：本研究為何認為傳統(tǒng)懸浮培養(yǎng)可能導致錯誤結(jié)論？
答案：因為懸浮培養(yǎng)未包含細胞通過粘附***的因素，而細胞間及細胞 - 基質(zhì)粘附是 hPBMCs 活化的關(guān)鍵因素，在體內(nèi)始終存在。例如，單核細胞產(chǎn)生自由氧種類的強度受整合素粘附受體調(diào)控，且 AD 患者的 PBMC 在懸浮培養(yǎng)時對 β- 淀粉樣肽刺激表現(xiàn)出抵抗性，忽視細胞粘附可能導致對細胞對外源性刺激的反應(yīng)評估不準確230。
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